江蘇血液制品內毒素檢測常見問題分析 湖州申科生物技術股份供應

湖州申科建立了標準化的低內毒素回收（LER）技術服務流程，全周期支撐內毒素檢測優化：7 個自然日內完成客戶溝通與 LER 確認，用天然鱟、重組鱟等方法檢測并出具報告；60 個自然日開展方法開發，分析 LER 成因（如螯合劑、蛋白質 IP）并研究去掩蔽方案；30 個自然日進行 HTS 驗證，完成 3 批 LER 實驗與干擾實驗，交付穩定試劑盒、操作規程及培訓；再協助方法轉移與 cGMP 驗證。流程每環節均圍繞內毒素檢測展開，確保企業高效解決 LER 問題，滿足法規要求。 在醫藥、生物制品及**器械等諸多領域，細菌內毒素檢測是保障產品質量與**的關鍵環節。江蘇血液制品內毒素檢測常見問題分析

內毒素檢測的實驗方案需遵循“標曲可靠性驗證（靈敏度復核）-稀釋倍數計算-干擾試驗”的完整流程，以保障檢測結果準確合規。首先進行標曲可靠性試驗，用標準內毒素制備至少3個濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數不超過10，下限濃度不低于鱟試劑標示檢測限），每濃度設 3 支平行管，同時做2支陰性對照；當陰性對照的吸光度小于或透光率大于標準曲線下限的檢測值或反應時間大于標準曲線下限的反應時間，對數據進行線性回歸，相關系數r的幅值≥0.980時試驗方有效，否則需重新操作。接著按公式 L=K/M 確定樣本內毒素限值，K 值依給藥途徑而定，M結合人均60kg體重、1.62m? 體表面積及上限給藥劑量計算，也可參考藥典行標。隨后明確有效稀釋上限倍數（MVD），即供試品允許稀釋的上限倍數，確保在此范圍內檢測限值。再開展樣本干擾試驗，制備供試品溶液（A）、供試品加標溶液（B，加標濃度為標曲中點）、標準曲線溶液（C）及陰性對照（D），按公式 R=(Cs-Ct)/λm×**計算加標回收率，50%-200%為合格；若鱟試劑、生產工藝等發生變化，需重新進行干擾試驗，保障內毒素檢測的可靠性。 北京原料藥內毒素檢測操作步驟內毒素干擾試驗回收率需在 50%-200%，驗證樣品基質不影響內毒素檢出。

內毒素檢測方法易受樣品基質干擾，法規要求在方法應用前必須進行干擾驗證，選擇標準曲線中點或一個靠近中點的內毒素濃度，作為供試品干擾試驗種添加的內毒素濃度計算回收率，若回收率在 50%-200% 范圍內，表明無明顯干擾；若回收率異常，需通過過濾、中和、透析、加熱處理等方式優化樣品前處理。方法學確認還需涵蓋線性范圍（如 0.005-5 EU/mL）、精密度（批內 CV≤15%）、檢測限（LOD≤0.01 EU/mL）等指標，確保方法在實際樣品檢測中穩定可靠，符合《美國藥典》 <85>、《中國藥典》通則 1143 等藥典要求。

樣品中的高滲透性成分（如高濃度鹽、糖）會通過改變反應體系滲透壓，抑制鱟試劑反應，影響內毒素檢測結果。例如，濃度為 70% 的葡萄糖溶液、高濃度氯化鈉溶液等，會形成高滲透壓環境，導致鱟試劑中的蛋白質脫水變性，喪失酶活性，進而使內毒素無法被正常檢測，出現假陰性。這類高滲透性基質的干擾機制明確 —— 通過破壞蛋白質結構影響酶促反應，且干擾程度與濃度正相關。為消除這類干擾，解決方案是使用內毒素檢查用水稀釋樣品：根據樣品滲透性高低，逐步稀釋至適宜濃度（通常需稀釋至滲透壓與生理鹽水接近），降低對蛋白質的脫水作用，恢復鱟試劑中酶的活性。稀釋過程中需注意，稀釋倍數需在方法驗證確定的 “無干擾稀釋范圍” 內，避免因過度稀釋導致內毒素濃度低于檢測限，確保內毒素檢測既能規避高滲透性抑制，又能準確捕捉微量內毒素。 繪制內毒素標準曲線時，起始濃度需統一為 1000EU/mL，避免稀釋誤差。

針對單核細胞活化反應測定法（MAT）通過檢測內毒素的生物活性，有效規避低內毒素回收（LER）對內毒素檢測的影響。其原理是：熱原（包括被掩蔽的 LPS）活化單核細胞表面的 TLR 受體，釋放 IL-6 等細胞因子，通過 ELISA 檢測 IL-6 濃度，結合標準曲線推算熱原含量。即使 LPS 因 LER 改變超分子結構，只要仍具生物活性，就能被 MAT 法識別。這種 “檢測活性而非結構” 的特性，使 MAT 法成為 LER 場景下內毒素檢測的重要補充，與其他方法協同構建高效可靠的熱原防控體系。 鱟試劑靈敏度復核至關重要，存放半年需重測，避免內毒素檢測出現假陰性或假陽性。上海重組蛋白內毒素檢測技術升級

細菌內毒素檢查用水需符合滅菌注射用水標準，內毒素含量有明確限值且無干擾。江蘇血液制品內毒素檢測常見問題分析

低內毒素回收（LER）的主要形成機制之一是螯合劑與非離子表面活性劑的協同作用，直接影響內毒素檢測結果。**步，樣品中的螯合劑（如檸檬酸鹽）會去除二價陽離子（Mg??、Ca??），削弱 LPS 聚集體的鹽橋結構，降低其剛性；第二步，表面活性劑（如吐溫 20）嵌入 LPS 分子，形成混合聚集體（膠體、層狀結構），改變 LPS 的超分子形態。LPS 從 “可檢測態” 轉為 “不可檢測態”，導致鱟試劑中的 C 因子無法與內毒素結合，內毒素檢測出現假陰性。這種變化是時間依賴的，與稀釋度無關，給常規內毒素檢測帶來獨特挑戰。 江蘇血液制品內毒素檢測常見問題分析